
По данным M. Gaballa et al. (2006), гипоксия стимулирует ангиогенез, активируя 128 генов ростовых факторов и провоспалительных цитокинов, в т.ч. гены ангиопоэтина 1/2, CSF, PDGFa/b, EGF-β, EGF-R3, TGF-β, VEGF-β, VG5Q, IL-1β, IL-6, MMP2/9, Ephrin A1/A2/A3, нейтрофиллина, урокиназы и т.д. Что касается ангиопоэтина (Ang), то Lei Ye et al. (2006) сравнивали в эксперименте прямое введение аденовирусного вектора, несущего ангиопоэтин (Ad-Ang-1), и опосредованное трансдукцией скелетных миобластов: во втором случае влияние на перфузию мышц было более в
Естественными ангиогенными стимулами являются ишемия, гипоксия, воспаление, механическое растяжение и некроз. Неоваскуляризация тканей идет по двум путям. Истинный ангиогенез представляет собой ответвление новых капилляров от существующих, что увеличивает их плотность в зоне ишемии и доставку крови в нее. Неоартериогенез — это трансформация предсуществующих артериол в небольшие артерии мышечного типа и ремоделирование предсуществующих коллатералей, что обеспечивает обходной кровоток.
Перспективным методом генной терапии при ИБС является терапевтический ангиогенез — введение в область ишемии ангиогенных факторов или их генов для стимуляции развития сосудов и улучшения кровотока в тканях, ограничения зоны ишемии и улучшения отдаленного прогноза. Ценность этих разработок очевидна, учитывая столь существенные недостатки малоинвазивной хирургии сердца, как невозможность реваскуляризации коронарных ветвей 2-го порядка и риск окклюзии шунта из-за развития тромбоза и гиперплазии интимы.
В стадии разработки находятся методы внутримиокардиального введения аденовирусных векторов для переноса генов, способных вызвать гиперплазию миоцитов, пациентам, перенесшим инфаркт миокарда. Внедрению их в клиническую практику препятствует как возникающее при этом повреждение кардиомиоцитов, так и иммуногенность аденовирусных векторных систем. В недавно опубликованной работе A. Abdel-Latif et al. (2006) продемонстрировано свойство трансформирующего фактора роста TGF-β1 усиливать потенциал кардиомиогенной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток скелетных мышц in vitrо. Изучается кардиомиогенный потенциал одного из важнейших промоторов ангиогенеза — сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF (в работе M. Guerrero еt al. (2006) — также с применением аденовирусного вектора).
Генная терапия как перспектива лечения больных ИБС
Для механической доставки векторов в сосуд используют внутрисосудистые и периваскулярные доставочные системы, а также перикардиальные, интрамиокардиальные и внутримышечные инъекции. При облитерирующих заболеваниях сосудов локальное введение генетического материала целесообразнее системного, а при периваскулярном введении векторов локальная трансфекция выше, чем при эндолюминальном (A. Fernandez-Ortis et al., 1994; R. Kornowsky et al., 2000). Внутрисосудистую доставку векторов осуществляют как путем их непосредственной инфузии в просвет сосуда, так и с помощью модификаций баллонных катетеров для ангиопластики. Для периваскулярной доставки применяют специальные катетеры с иглами, что позволяет избежать попадания генетического материала в системный кровоток. При облитерирующих заболеваниях сосудов нижних конечностей возможны также внутримышечные инъекции векторов в зоны ишемии. Введение векторов непосредственно в миокард осуществляют во время аортокоронарного шунтирования (АКШ) или из полости левого желудочка, применяя катетеры с иглами для трансэндокардиальных инъекций (R. Kornowsky et al., 2000).
В целом вирусные векторы генной терапии характеризуются высокой эффективностью (но низким тропизмом к сосудам), возможностью применения как высоких, так и средних доз вирусов-«переносчиков», а также вариабельностью ядерной направленности. Возможно и системное, и локальное применение вирусных векторов. Наиболее эффективным считается Ad/lenti, а негативные результаты получены при попытках применения аденоассоциированного вируса AAV-2 (Gao et al., 2002; Gregorevic et al., 2005). Эффективность, селективность и ядерная направленность невирусных переносчиков генов существенно ниже.
Вирусные векторы представлены ослабленными или модифицированными ретровирусами, аденовирусами, аденоассоциированными вирусами, вирусом герпеса 1-го типа, лентивирусами и т.д. Ретровирусные векторы применяются только для сосудистой генной терапии ex vivo, а неиспользование in vivo обусловлено их недостатками (табл. 1). Аденовирусные векторные системы в сотни и тысячи раз эффективнее, чем плазмидные и ретровирусные, но обеспечивают лишь кратковременную экспрессию введенных генов (до 4 недель), а повторные введения чреваты развитием воспалительных и иммунных реакций, особенно в случае 1-го поколения аденовирусов. Развитие иммунного ответа на вирусные белки может сопровождаться элиминацией внесенных терапевтических генов. Лентивирусы (ВИЧ) также способны к трансфекции неделящихся клеток, но они потенциально опасны для человека. Эффективен и перенос генов с помощью гемагглютинирующих вирусов, но применение этого вектора ограничено неспецифическим связыванием вирусов с эритроцитами. Перспективно использование аденоассоциированных вирусов — непатогенных, способных к трансфекции неделящихся клеток и обеспечению длительной экспрессии введенных терапевтических генов.
Невирусные векторы представлены либо плазмидной ДНК, либо комплексами ДНК с липосомами, аденовирусными белками, трансферрином, полилизином и т.д. Плазмидная ДНК не встраивается в геном хозяина и обеспечивает лишь 2–4-недельную экспрессию гена. Кроме того, трансфекция клеток плазмидной ДНК in vivo составляет всего 0,1 %, и поэтому метод используют при необходимости некоторое время секретировать белок, способный по паракринному механизму действовать на другие клетки. Если же требуется длительная экспрессия белка, активного только в той клетке, где он синтезирован, используют модификации вектора. Так, для повышения трансфекции клеток сосудов in vivo до 4–5 % применяют липосомальный плазмидный вектор, при этом положительный заряд обволакивающих ДНК липидных пузырьков способствует проникновению ДНК через отрицательно заряженную мембрану клетки-мишени.
Векторные системы бывают вирусными и невирусными. Для клинического применения они должны обладать определенными качествами, и следует отметить, что универсальных векторов не существует. Выбор вектора и метода его доставки определяется конкретной задачей генной терапии (в какие клетки требуется ввести терапевтический ген, как долго требуется его экспрессия и в каком количестве и т.д.). Большинство доступных на сегодня векторов для терапии in vivo обеспечивает временную экспрессию перенесенных генов в клетке, поэтому и лучшие результаты генной терапии получены при заболеваниях и состояниях, не требующих пожизненной активности терапевтических генов (например, при рестенозах просвета артерий, развивающихся после баллонной ангиопластики, стентирования или атерэктомии).
Для введения генов в клетки-мишени сосудов используют оба подхода, но значительно чаще применяют прямую методику. Кроме выбора потенциально терапевтических генов успех лечения зависит от характеристик специальных генных носителей (векторных систем / векторов) и от средств механической доставки векторов к клеткам-мишеням. В идеале векторы должны обеспечивать эффективное и безопасное проникновение и экспрессию терапевтических генов в клетках-мишенях, а средства механической доставки векторов к этим клеткам — легко и нетравматично помещать вектор в нужный участок сосуда, избегая попадания генетического материала в системный кровоток. Ограниченная емкость векторов усложняет доставку больших генов.
Различают непрямую (клеточную, ex vivo) и прямую (in vivo) генную терапию. При терапии ex vivo специфические типы клеток выделяют из организма и культивируют вне его, затем в них вводят чужеродные терапевтические гены, отбирают трансформированные клеточные клоны и вводят их тому же человеку. Этот вид генной терапии используется для генетической трансформации эндотелиальных клеток и последующего покрытия ими венозных шунтов и внутрисосудистых стентов. Генная терапия in vivo основана на прямом введении терапевтических генов (с помощью векторных систем) в стенку сосуда, миокард или скелетные мышцы.
Среди методов модификации генной функции чаще всего используют внесение (перенос) терапевтического гена. Разрабатываются методы коррекции дефектных генов (при мутациях, изменяющих небольшой участок ДНК), замены дефектных генов нормальными или блокады их экспрессии, методы усиления экспрессии нормальных генов и восстановления экспрессии блокированных генов. Перспективно и «наращивание» гена, при котором к нему добавляется часть, изменяющая функцию. Разрабатывается метод, при котором вектор будет содержать ген, кодирующий продукцию необходимого белка, а также молекулярную структуру, способную регулировать экспрессию гена в зависимости от приема внутрь специального лекарственного средства.
Теоретически генная терапия может быть проведена в отношении и соматических, и половых клеток. При соматической генной терапии изменения, внесенные в геном пациента, не передаются потомству. Аналогичные воздействия на половые клетки с целью передачи генетической информации последующим поколениям в настоящее время не применяют, в т.ч. и по этическим соображениям.
Генная терапия (gene therapy) — это перспективная экспериментальная терапия, направленная на выключение дефектных генов или восстановление их нормальной функции при заболеваниях, на течение которых влияет элиминация или предоставление соответствующих генов / белков, а прочие методы лечения оказываютcя неэффективными.
Рубрики: Семейная медицина, Терапия
Professor of Molecular Medicine, Division of Cardiovascular and Medical Sciences University of Glasgow, UK
Генная терапия как лечебная стратегия при ишемической болезни сердца
Журнал «Внутренняя медицина» 1(1) 2007
Генная терапия как лечебная стратегия при ишемической болезни сердца: версия для печати | Интернет-издание "Новости медицины и фармации"